臭氧杀菌机理以氧化作用破坏微生物膜的结构实现杀菌作用。臭氧首先作用于细胞膜，使膜构成成份受损伤而导致新陈代谢障碍，臭氧继续渗透穿透膜而破坏膜内脂蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，导致细胞溶解、死亡。而臭氧灭活病毒则认为氧化作用直接破坏其核糖核酸RNA或脱氧核糖核酸DNA物质而完成的。 臭氧水杀灭情况有些不同，其氧化反应有两种，
微生物菌体既与溶解水中的臭氧直接反应，又与臭氧分解生成之羟基OH的间接反应，由于羟基OH为极具氧化性的氧化剂，因此臭氧水的杀菌速度极快。 臭氧能氧化分解细菌、病毒内部氧化葡萄糖所必须的葡萄糖氧化酶，并直接与细菌、病毒发生作用，氧化并穿透其细胞壁，破坏其细胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使细菌、病毒的新陈代谢和繁殖过程遭到破坏，而夺取细菌病毒的生命。同时还可以渗透细胞膜组织、侵入细胞膜内作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖，使细胞发生通透性畸变，导致细胞溶解性死亡，并将死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热源（内毒素）等溶解死亡。综观无菌技术对微生物作用的原理可分为抑菌型、杀菌和溶菌型三种。臭氧灭菌消毒属于溶菌型剂体，可以达到“彻底、永久地消灭物体内部所有微生物的目的”。而且它的作用是瞬间完成的。
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